SPECII MEDICINALE INDIGENE CU POTENŢIAL ANTIOXIDANT ŞI ANTIMICROBIAN Şef lucr.dr. Daniela Benedec Disciplina de Farmacognozie UMF “Iuliu Haţieganu” Cluj-Napoca

Obiective Antioxidantă Polifenoli totali Antimicrobiană Principii active Polifenoli totali Acţiuni Antioxidantă Antimicrobiană Forme farmaceutice Extracte uscate Comprimate

Specii vegetale Lamiaceae Ocimum basilicum Origanum vulgare Mentha longifolia M. viridis var. crispa Hyssopus officinalis Teucrium chamaedrys Lamiaceae Ocimum basilicum Origanum vulgare Mentha longifolia Mentha viridis Hyssopus officinalis Teucrium chamaedrys

Specii vegetale Fabaceae Asteraceae Populus nigra Populus tremula Salicaceae Trifolium repens Trifolium pratense Fabaceae Achillea distans spp. distans Achillea distans spp. alpina Asteraceae

Euphrasia rostkoviana Specii vegetale Euphrasia rostkoviana Scrophulariaceae Centaurium erythraea Gentianaceae

Motivarea alegerii temei de cercetare Controlul calităţii fitopreparatelor Existenţa pe piaţa românească a suplimentelor nutritive declarate antioxidante, cu compoziţie şi acţiune insuficient studiate şi argumentate Speciile vegetale indigene - materie primă importantă care trebuie valorificată pe baze ştiinţifice

Polifenoli - generalităţi Polifenolii protejează celulele împotriva SRO şi a peroxidării lipidice Ar-OH + R· = ArO· + RH chelatarea metalelor

Polifenoli – analiză HPLC/MS Metoda HPLC-MS metoda standardului extern Sistem Agilent 1100 HPLC Series (Agilent, USA), pompă binară, degazor G1322A, autosampler, termostat (setat la temperatura de 48°C), detector UV HP 1100 Series, coloană Zorbax SB-C18 100 mm x 3.0 mm i.d., 3.5 µm (Agilent, USA) Faza mobilă: metanol:soluţie acid acetic 0,1%; eluţia s-a realizat în gradient liniar datele au fost înregistrate cu un detector UV la 330 nm, volumul de injectare 5µl  

Ocimum basilicum Compuşii polifenolici în O. basilicum (mg polifenoli/100g pv) Compuși polifenolici tr (min) Proba 1 Proba 2 Proba 3 Proba 4 acid caftaric 2.10 283.56 1595.32 74.55 164.18 acid gentisic 2.15 x acid cafeic 5.60 82.99 88.45 60.30 32.82 acid clorogenic 5.62 acid p-cumaric 8.70 acid ferulic 12.20 acid sinapic 14.30 hiperozida 18.60 - izoquercitrina 19.60 rutozida 20.20 665.05 658.44 388.10 147.11 miricetol 20.70 fisetina 22.60 quercitrina 23.00 quercetol 26.80 patuletina 28.70 luteolina 29.10 kaempferol 31.60 apigenina 33.10 Proba 1 Proba 2 Proba 3 Proba 4

Origanum vulgare Compuşii polifenolici în O. vulgare (mg polifenoli/100g pv) Compuși polifenolici tr (min) Proba 1 Proba 2 acid caftaric 2.10 - x acid gentisic 2.15 acid cafeic 5.60 acid clorogenic 5.62 acid p-cumaric 8.70 2,2 3,41 acid ferulic 12.20 1,27 acid sinapic 14.30 hiperozida 18.60 6,68 izoquercitrina 19.60 93,43 rutozida 20.20 8,74 quercitrina 23.00 48,56 quercetol 26.80 9,13 patuletina 28.70 luteolina 29.10 21,7 8,56 apigenina 33.10 4,37 1,92 Proba 1 Proba 2

Teucrium chamaedrys / Hyssopus officinalis Compuşii polifenolici în Teucrium / Hyssopus (mg polifenoli/100g pv) Compuşi polifenolici Teucrium Hyssopus Acid caftaric - x Acid gentisic Acid cafeic Acid clorogenic Acid p-cumaric 6,9004 52,56 Acid ferulic 14,2591 188,08 hiperozida isoquercitrina rutozida quercetol 4,5318 luteolina 34,6747 4,68 kaempferol apigenina 5,07938 2,86 Cromatograma HPLC pentru Teucrium chameaedrys Cromatograma HPLC pentru Hyssopus officinalis

Mentha sp./ Trifolium sp. Compuşii polifenolici în Mentha sp./Trifolium sp. (mg polifenoli/100g pv) Compuşi polifenolici` M. viridis var. crispa M. longifolia acid caftaric x acid gentisic - acid cafeic acid clorogenic acid p-cumaric 15,24 10,03 acid ferulic 27,32 10,51 acid sinapic 6,60 5,84 hiperozida isoquercitrina 15,80 rutozida 0,82 quercetol 0,45 patuletina luteolina 4,68 11,99 kaempferol apigenina 7,82 Compuşi polifenolici Trifolium repens Trifolium pratense acid caftaric - x acid gentisic acid cafeic acid clorogenic acid p-cumaric 4,01 3,04 acid ferulic 15,06 22,55 acid sinapic 4,66 hiperozida 25,68 69,84 isoquercitrina 64,50 rutozida 5,27 quercitrina 25,87 quercetol 1,33 9,48 luteolina 2,87 kaempferol 9,45 6,27 apigenina 0,57 1,15

Populus sp. Compuşii polifenolici în Populus sp. (mg polifenoli/100g pv) Compuşi polifenolici P. tremula P. nigra Acid gentisic - Acid cafeic x Acid clorogenic Acid p-cumaric 2.567 148.457 Acid ferulic 4.248 16.180 hiperozida isoquercitrina 93.781 4.707 quercitrina 14.938 quercetol 0.567 4.641 luteolina 2.041 kaempferol 2.688 apigenina 7.628 Cromatograma HPLC pentru P. tremula Cromatograma HPLC pentru P. nigra

Achillea sp. Compuşii polifenolici în A. distans (mg polifenoli/100g pv) Compuşi polifenolici A. distans ssp. distans distans ssp. alpina Acid caftaric - Acid gentisic Acid cafeic x Acid clorogenic Acid p-cumaric Acid ferulic hiperozida 2.052 isoquercitrina rutozida quercitrina quercetol 1.448 1.1160 patuletina luteolina 763.125 52.652 kaempferol apigenina 264.844 13.900 Cromatograma HPLC pentru A. distans ssp. distans Cromatograma HPLC pentru A. distans ssp. alpina

Centaurium / Euphrasia Compuşii polifenolici în Centaurium / Euphrasia (mg polifenoli/100g pv) Compuşi polifenolici Centaurium erythraea Euphrasia rostkoviana Acid cafeic x Acid clorogenic Acid p-cumaric 43.01 - Acid ferulic 15.27 Acid sinapic 12.85 hiperozida rutozida 12.99 quercitrina 3.72 quercetol 26.33 luteolina kaempferol 34.52 apigenina 0.77 Cromatograma HPLC pentru C. erythraea Cromatograma HPLC pentru E. rostkoviana

Polifenoli totali – determinare cantitativă

Acţiunea antioxidantă DPPH TEAC HAPX RES

Acţiunea antioxidantă prin DPPH DPPH• (violet) este redus la un compus galben Valorile AAO sunt exprimate ca şi cantitatea de AO ce descreşte absorbanţa DPPH•

Acţiunea antioxidantă prin DPPH Rezultatele obţinute prin metoda DPPH Probe DPPH (%) Achillea distans ssp. distans 26,69 Achillea distans ssp. alpina 32,37 Mentha viridis var. crispa 34,68 Mentha longifolia 44,01 Ocimum basilicum 25,44 Origanum vulgare 91,12 Hyssopus officinalis 12,26 Teucrium chamaedrys 65,19 Populus tremula 60,79 Populus nigra 47,13 Trifolium pratense 16,37 Trifolium repens 15,11 Euphrasia rostkoviana 6,70 Centaurium erythraea 4,10 BHT (antioxidant standard) 94,77

Inhibiţia activităţii ascorbat peroxidazice a hemoglobinei (HAPX) ascorbat + H2O2 + metHb + probe monitorizarea HAPX - spectrofotometric la 290 nm, urmărindu-se consumul de ascorbat, prin oxidare de către H2O2 sub cataliza Hb (~ascorbat peroxidaza), se determină caracterul antioxidant al probelor Peroxizii - stres oxidativ, în prezenţa unui substrat (Hb), iniţiază reacţii de oxidare a Hb Ascorbat - previne oxidarea globinelor de către peroxizi şi de a reduce forma oxidată (feril), regenarând Hb formând un ciclu catalitic. + Proba efect de inhibiţie a reacţiei, proba preia rolul ascorbatului de a proteja Hb.

Inhibiţia activităţii ascorbat peroxidazice a hemoglobinei (HAPX) Probe % inhib TP 30.2252 TR 21.6838 PN 35.0139 PT 21.8306 OV 25.9422 OB 18.8448 HO 16.169 TC 12.8732 MV 2.25159 ADA 10.279 ML 10.5482 ADD 4.91924 E -2.0313 C 6.21635 Inhibiția consumului de ascorbat de către Hb in timp ce acționează în calitate de peroxidază

Analiza capacităţii antioxidante cu ABTS (TEAC) generarea ABTS•+ (ABTS - acidul 3-etil-benzotiazolin-6-sulfonic + enzimă - laccaza) se urmărește în timp viteza de consum al radicalului (conținutul ABTS• generat a fost convertit ĩn echivalent Trolox prin utilizarea unei curbe de calibrare (R2= 0.9987), construite cu 0, 2, 4, 6, 8, 10 22µL trolox) procesul se monitorizează la 734 nm timp de 600 s la temperatura camerei

Analiza capacităţii antioxidante cu ABTS (TEAC) Probe TEAC (µM Trolox/mg pv) TP 39.5036 TR 50.8612 1. PN 205.868 3. PT 134.654 2. OV 184.522 OB 25.6943 HO 57.3938 TC 87.7729 MV 56.0232 ADA 46.7228 ML 61.9617 ADD 42.1396 E 51.8444 C 51.2562

Analiza capacităţii antioxidante cu ajutorul spectroscopiei RES se pot cuantifica radicalii liberi într-un câmp magnetic absorb radiaţiile de microunde provenite de la o sursă externă Condiții de lucru: spectrometru Brucker EMX Micro - obținerea spectrelor RES frecvența de microunde 9,43 GHz, puterea de microunde 15,89 mW, frecvența de modulare 100 kHz, amplitudinea 3G, constanta de timp 10.24 ms. probe + tratament alcalin (NaOH 10M)

Analiza capacităţii antioxidante cu ajutorul spectroscopiei RES Probe RES TP 50000 TR 25000 PN 350000 PT 1000000 OV 900000 OB 80000 HO 100000 TC 250000 MV 600000 ADA 30000 ML 275000 ADD 35000 E C 2000 Scăderea semnalului RES în timp este o măsură a capacităţii antioxidante. Numeric se calculează valoarea derivatei a doua a spectrelor RES (aria semnalelor) care se reprezintă grafic în funcţie de timp

Acţiunea antioxidantă Probe mg polifenoli/g pv DPPH (%) TEAC(µM Trolox/mg pv) HAPX (%) RES Achillea distans ssp. distans 108,5 26,69 42,13 4,919 35000 Achillea distans ssp. alpina 172,5 32,37 46,72 10,279 30000 Mentha viridis var. crispa 118,7 34,68 56,02 2,251 600000 Mentha longifolia 87,3 44,01 61,96 10,5 275000 Ocimum basilicum 149,7 25,44 25,69 18,844 80000 Origanum vulgare 211,4 91,12 184,52 25,942 900000 Hyssopus officinalis 83,7 12,26 57,39 16,169 100000 Teucrium chamaedrys 162,1 65,19 87,77 12,8732 250000 Populus tremula 146,5 60,79 134,65 21,83 1000000 Populus nigra 106,5 47,13 205,86 35,013 350000 Trifolium pratense 73,8 16,37 39,50 30,225 50000 Trifolium repens 34,1 15,11 50,86 21,683 25000 Euphrasia rostkoviana 23,6 6,70 51,84 -2,0313 Centaurium erythraea 15,6 4,10 51,25 6,2163 2000

Activitatea antimicrobiană Tehnica de difuziune ĩn agar a godeurilor Metoda indică susceptibilitatea tulpinii bacteriene pentru substanţele testate, prin aparitia unei zone de inhibiţie ĩn jurul godeurilor Diametrul zonei rezultate este considerat proporţional cu gradul de susceptibilitate - <10 mm (rezistent) + 10-15 scăzut (intermediar, 13-14) ++ 15-20 moderat (> 15 – susceptibil) +++ > 20 mare

Activitatea antimicrobiană Probe Inhibition zone in diameter (mm) Salmonella typhymurium Escherichia coli Staphylococcus aureus Listeria monocytogenes PT 10; + 8; - PN 10 + 13; + 15; ++ ADA 6; - 12; + ADD 7; - 17; ++ OB 11; + OV 14; + HO TC 20; +++ MV ML TP 16; ++ TR C E Gentamicin 18 22 19

Extracte vegetale uscate (1:10) adsorbţia tincturilor (1:10) pe un amestec de pulberi: 33,33% lactoză (Granulac 200, Meggle Germania) şi 66,67% celuloză microcristalină (VivaPur PH 102, JRS Pharma, Germania) în uscătorul în pat fluidizat Strea 1(Aeromatic A.G., Elveţia) configurat în varianta top spray

Comprimate extracte uscate + 1% stearat de magneziu + 3% amidon glicolat de sodiu 480 mg, rotunde, colorate Caracteristici Tablete de Achillea Tablete de Origanum Tablete de Ocimum Masa (mg) 480 Diametru (mm) 10 Timp de dezagregare (min) 1 4 1,5 Rezistență mecanică (N) 130 300 172

Concluzii Vă mulţumesc! S-au studiat 14 specii vegetale indigene. S-a determinat acţiunea antioxidantă prin mai multe metode. Extractele uscate vegetale cu conţinut mare ĩn polifenoli au fost comprimate ĩn tablete. Vă mulţumesc!